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奈良先端科学技術大学院大学

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呼吸の重要タンパク質、シトクロムcが鎖状に連結し、機能を失うメカニズムを半世紀ぶりに解明 - タンパク質構造変異が引き起こす病気の原因究明に期待 -(2010/7/10)
奈良先端科学技術大学院大学 物質創成科学研究科の超分子集合体科学講座(廣田俊教授)の研究グループと同研究科エネルギー変換科学講座、兵庫県立大学 生命理学研究科(樋口芳樹教授)、独立行政法人理化学研究所 放射光科学総合研究センター、同志社女子大学薬学部および西華師範大学の共同研究チームは、生物の呼吸に不可欠なタンパク質であるシトクロムc (cyt c)について、その分子の立体構造が変化し、いくつもつながった塊(多量体)が鎖状に伸びた構造を形成(ポリマー化)することにより機能を失うメカニズムを初めて明らかにした。
平成22年7月7日
国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学
兵庫県立大学

 奈良先端科学技術大学院大学(学長:磯貝彰)物質創成科学研究科の超分子集合体科学講座(廣田俊教授)の研究グループと同研究科エネルギー変換科学講座、兵庫県立大学(学長:清原正義)生命理学研究科(樋口芳樹教授(理化学研究所 客員研究員))、独立行政法人理化学研究所(理事長:野依良治)放射光科学総合研究センター(センター長:石川哲也)、同志社女子大学薬学部および西華師範大学の共同研究チームは、生物の呼吸に不可欠なタンパク質であるシトクロムc (cyt c)について、その分子の立体構造が変化し、いくつもつながった塊(多量体)が鎖状に伸びた構造を形成(ポリマー※1化)することにより機能を失うメカニズムを初めて明らかにした(図1、図2)。若年性認知症、肝硬変、肺気腫、血栓症などを起こすセルピン病※2では、鎖状に伸びポリマー化したタンパク質が生体組織内にゴミのように蓄積し、疾病を引き起こすとされており、本研究は、タンパク質構造変異が引き起こす病気の原因解明や予防につながる研究と期待されている。

 cyt cは、細胞内の呼吸の場である小器官のミトコンドリアに含まれる。呼吸に必須のタンパク質で、変性すると鎖状に伸び、ポリマー化することが約50年間前から知られていた。しかし、どのような仕組みで変性するか、そのメカニズムは不明のままであった。廣田教授らは、cyt c多量体を作製し、cyt c分子2つ、3つ、4つから成る大きさの揃った純粋な多量体をそれぞれ得て、それらの分子構造と性質を解析する研究を重ねてきた。一方、樋口教授らはそれらの試料について結晶化に成功し、大型放射光施設SPring-8の放射光X線を使って分子構造を解明した。その結果、cyt c が多量体を形成する際、1分子(単量体)をいくつかのパーツ(部分)からなる構造ユニットとしてとらえると、2つの分子が出合った時、それぞれ対応するパーツを交換して互いに入れ込ませ、パズルのように組み合わされる「ドメインスワッピング※3機構」が起こっていることを突き止めた。この現象が複数の分子で連続して起きることにより、cyt c分子が連続的に鎖状に連なってポリマー化するメカニズムを明らかにした。この成果は、7月6日(日本時間:7月7日)に米国科学アカデミー紀要(Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS)オンライン版に掲載された。

 タンパク質はさまざまな種類のアミノ酸が長い鎖のようにつながり、その配列(並び順)に従って特定の立体構造を形成して機能を発現する。しかし、タンパク質が構造変性した時、アミノ酸の長い鎖が元通りにきちんと再フォールディング(折れ畳み)しなかったり、あるいは細胞から排除するための分解が正常に起こらなかったりした場合、構造変性して機能を失ったタンパク質が生体組織内にゴミのように蓄積し、それが原因で疾病が引き起こされる。今回明らかとなったcyt cの変性メカニズムは、セルピン病で提唱されているメカニズムと非常に似ており、本研究成果は病気とも関連が深いタンパク質変性メカニズムの解明に役立つとみられる。

(論文)
"Cytochrome c polymerization by successive domain swapping at the C-terminal helix"
Shun Hirota, Yoko Hattori, Satoshi Nagao, Midori Taketa, Hirofumi Komori, Hironari Kamikubo, Zhonghua Wang, Isao Takahashi, Shigeru Negi, Yukio Sugiura, Mikio Kataoka, and Yoshiki Higuchi
Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS), Published online before print July 6, 2010


《解説》
 ミトコンドリア内の呼吸に関わる反応で、酸素を水に還元する酵素に電子を伝達する役目のシトクロムc (cyt c)は単量体で機能し、一方で細胞の自殺であるアポトーシスが誘導される際、ミトコンドリアから放出される。cyt c は変性するとポリマー化するが、そのメカニズムは約50年間不明であった。廣田教授らはウマのcyt cを使い、cyt c分子2つ、3つ、4つと大きさの揃った多量体を作製単離する方法を開発し、各多量体のX線溶液散乱測定、示差走査熱量測定などタンパク質の構造と熱力学的性質を分子レベルで測定、解析する研究を重ねた。樋口教授らは,それらのうち2量体と3量体のX線結晶構造解析を行った。その結果、cyt c 単量体が構造ユニットとなったドメインスワッピング機構により、cyt c 分子が連続的にポリマー化するメカニズムを明らかにした(図1、図2)。

 具体的な実験方法は、まずcyt c単量体、2~4量体、40量体ほどの大きな多量体をそれぞれ精製した。反応の場である活性部位の構造やタンパク質の局所的な立体構造である二次構造は、cyt c 2~4量体や40量体ではそれぞれ似ているが、単量体の構造とは若干異なることが、光の吸収スペクトル、CD(円偏光二色性)スペクトルという分子構造を測定する方法により明らかになった。

 さらに、SPring-8の理研構造ゲノムIIビームラインBL26B2の高輝度放射光X線を利用した結晶構造解析により、cyt c 2量体と3量体を構成するアミノ酸のC末端領域がドメインスワッピングしていることが判明し、結晶中のcyt c 2量体および3量体の構造では、電子伝達に重要な鉄-Met(メチオニン、アミノ酸の一種)結合が解離していた。

 また、液体に溶けた状態の分子を測定するX線溶液散乱測定により、水溶液中のcyt c 2~4量体は多量体数の増加とともに鎖状に連なって伸びた構造をしていた。構造変化に伴う熱量変化を分析する示差走査熱量測定により、各多量体が単量体に解離するとき、モノマーユニット当たり約20 kcal/molのエネルギーが放出された。このエネルギーには、多量体の解離に伴い、Metがヘムに再配位することによる安定化エネルギーが大きく寄与すると推測された。

 以上より、cyt c 2~4量体と40量体付近の多量体のヘム配位構造と二次構造はそれぞれ類似しており、酸化型ウマcyt cはC末端領域が連続的にドメインスワッピングし、タンパク質が鎖状に連なってポリマー化すると推測された。

《研究の位置づけ》
 タンパク質はアミノ酸配列に従って特定の立体構造を形成して機能を発現する。しかし、タンパク質が構造変性した時、タンパク質の再フォールディングや分解が正常に起こらないと、構造変性したタンパク質が生体組織内に蓄積し、コンフォメーション(フォールディング)病※2(アルツハイマー病、パーキンソン病、牛海綿状脳症(狂牛病)、セルピン病など)が引き起こされる。最近、セルピンの変異体がポリマー化することで遺伝病であるセルピン病が発症することが報告されたが、未だほとんどのタンパク質で凝集体の生成メカニズムは不明であり、その解明はライフサイエンスの最重要課題の一つである。

 本研究により、最も基本的なタンパク質の一つであるcyt cの凝集体生成メカニズムが解明された。本メカニズムは、コンフォメーション病の一つであるセルピン病でセルピンの2量体構造から提唱されているメカニズムと非常に似ており、本研究でポリマー化をさらに具体的に実験で確かめたことにより、タンパク質の基本的な性質を示すとともに、これらの病気のタンパク質変性メカニズムの解明に役立つことが期待される。
http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2010/100707-2

緑色植物の光合成をモデルにフラーレンのがん治療効果高める ~光線力学治療法における光線過敏症の解決の可能性~(2010/4/12)
【概要】
 奈良先端科学技術大学院大学(学長:磯貝彰)物質創成科学研究科バイオミメティック科学講座の池田篤志准教授らのグループは、ナノテクノロジー(超微細技術)の素材として期待されるサッカーボール状の分子C60(フラーレン、球状炭素分子)を蛍光色素とともにリポソームという人工細胞膜のカプセルに閉じ込めて、光線力学治療に使われている皮膚透過性の高い長波長領域(600~700 nm)の光を照射してがん細胞を死滅させることに成功した。C60自身は光エネルギーを効率よく血液中に溶けこんだ酸素に受け渡し、がん細胞を死滅させる活性酸素を発生させる能力は高いが、残念ながら光エネルギーの吸収能力が非常に低い。そこで緑色植物の光合成で葉緑体の特定の色素が太陽光エネルギーをアンテナのようにキャッチする仕組みをまねて、人工細胞膜内に光エネルギーを吸収する能力の高い蛍光色素を近くに共存させることによって、間接的に光エネルギーをC60に移動させる方法を考案しこの問題点を解決した。
 光合成のシステムを模倣した本システムは、緑色植物の葉が秋になると朽ち果て光合成ができなくなるのと同様、C60を封じ込め水溶化しているリポソームが崩壊すると光活性(光毒性)が消える。このため、従来の光増感剤で問題となっている手術後も光に反応しやすくなる“光線過敏症”を解決する道を拓くものと期待される。この光線過敏症の問題を解決できれば、光線力学的療法などがん治療において、術後暗所にこもらなくてはならないという患者の精神的な負担を軽減できる可能性がある。
この成果は、平成22年4月8日(木)付けでアメリカ化学会誌(ACS Medicinal Chemistry Letters)にオンラインで掲載されております。

【解説】
-内容-
 開発したのは「光線力学治療法」と呼ばれるがん治療法で用いられる光増感剤の効果を高めるものである。光線力学治療法では、光増感剤を静脈から投与して患部に集積させた後、光ファイバーなどで光を照射する。光により励起された光増感剤がそのエネルギーを溶存酸素に渡すことで活性酸素を発生してがん細胞を破壊する。
従来の光増感剤は光エネルギーを吸収する役割とそのエネルギーを溶存酸素に渡す役割を一つの分子が担っていた。C60を光増感剤として用いる場合、後者の活性酸素を発生させる能力が非常に高いことが知られていた(有機溶媒中、量子収率100%)が、前者の光を吸収する能力が極端に低かった。そこで、池田准教授らは光を吸収する部分として緑色植物の光合成でいう“光アンテナ”を導入することにした。この光アンテナとなる蛍光色素と活性部位となるC60を、リポソームという人工細胞膜のカプセルに高濃度で封じ込めた(図1)。このリポソーム水溶液に光を照射すると、まず蛍光色素が600~700 nm の波長の光を吸収し、そのエネルギーをいったんC60に渡し、さらにC60が溶存酸素にエネルギーを伝搬し活性酸素(一重項酸素)を発生させることがわかった。発生した活性酸素はがん細胞を死滅することが示された。この光細胞毒性は従来の光増感剤・フォトフリンと同等であることが示された。
 光アンテナを利用する利点は、C60の可視光領域の吸収が小さいという欠点を補うのみではない。光アンテナとして利用する蛍光色素を変えることによって、吸収極大(その化合物が最も光を吸収できる波長)を変化させることができる。そのため、病院に既に導入されているレーザー照射装置の波長に合った色素を選択でき、光増感剤に合ったレーザー装置を新たに準備する必要がない。
 一方、蛍光色素のみ、もしくはC60のみをリポソームに封入したものではそれぞれ活性酸素がほとんど発生せず、がん細胞に対する光毒性がないことが示された(図2)。この理由は、それぞれ蛍光色素が光励起されるものの、直接溶存酸素にそのエネルギーを伝搬できないこと、およびC60が照射波長の光を吸収できないため励起されないことによる。以上の結果は、リポソームが崩壊し、蛍光色素とC60が離れるとエネルギー移動が起こらなくなるため、毒性が消えることを意味する。つまり、従来の光増感剤では光過敏症を避けるためには、光増感剤が代謝されるまで患者の方が暗所にいる必要があったが、本系ではリポソームが崩壊すれば代謝を待たずに光毒性がなくなるため光過敏症の問題を解決できる可能性があることを示している。実際に、蛍光色素とC60を別々のリポソームに封入して混合した際には光細胞毒性がないことが示された。

今後の展開 - フラーレンと蛍光色素の組み合わせの変更、リポソーム中でのそれぞれの最適濃度を決定し、さらなる活性向上を目指す。また、任意にリポソームを崩壊できるシステムを現在研究しており、これが実現できればがん治療後すぐに光増感剤の光毒性を消去できることになるものと期待される。最終的には、マウス個体実験を経て、がん治療薬としての評価を行なっていく予定である。

解説

●フラーレンとは
 炭素のみからなる閉殻構造を持ち、ダイヤモンド、グラファイトに次ぐ第3の炭素同素体である。直径約1ナノメートル。フラーレンには炭素60個からなるC60以外にも、C70, C76, C78, C82, などが含まれ、これらは市販されている。C60の発見により1996年に米英の3人の化学者(スモーリー、クロトー、カール)がノーベル賞を受賞している。最近では高校の化学の教科書でも紹介され、大変有名となっている。

●光線力学治療法(PDT)とは
 がん治療法として多様な方法が用いられてきているが、その一つとして光線力学治療法(PDT)が注目されている。PDTとは、ポルフィリン誘導体などの光増感剤が、腫瘍組織・新生血管へ特異的に集積し、一重項酸素などの活性酸素が強い細胞破壊の効果があることを利用した治療法である。この方法では、可視光を照射したところのみ細胞破壊が起こるため、正常細胞に大きな障害を与えることが無く、比較的低エネルギーの可視光を用いるため、人体への影響が少ないとされている。現在は、フォトフリンやレザフィリンと呼ばれるPDT薬剤が用いられている。
 PDTは肺、食道、胃、子宮頚部の早期がんの治療のみならず、眼科疾患である加齢黄班変性に対する治療法としても臨床的に用いられている。
http://www.naist.jp/pressrelease/detail_j/topics/877/
http://www.naist.jp/topics_pdf/admin_c1dc3a2a1f2e2cbc1c2f039a19ff6ad5_1271052071_.pdf

バイオの力で高品質シリコン薄膜を作製(2007/3/20)
 奈良先端科学技術大学院大学 物質創成科学研究科の冬木 隆 教授、浦岡行治 助教授らの研究グループと松下は共同で、タンパクを吸着させたシリコンに対し、5-6秒程度加熱処理することによりシリコン薄膜を得る、世界初のバイオテクノロジーを利用した短時間シリコン薄膜作製技術を開発した。
 本技術は、薄膜トランジスタと呼ばれる高性能なスイッチの機能を持つ装置を実現するために、重要なもの。プラスチックなどフレキシブルなフィルムを用いることにより、安価な薄膜トランジスタが作製できるようになり、画面とコンピュータが一体化したシート状のコンピュータやメガネなどの代わりに身につけたコンピュータ(ウェアラブルコンピュータ)など幅広い応用が期待することができる。